- Hoischen et al. 2010. Schinzel-Giedion syndrome

Schinzel-Giedion syndrome에 걸린 4명의 비혈연 환자를 엑솜 시퀀싱하여 SETBP1 유전자가 이 질환의 원인 유전자이고 이 돌연변이가 de novo임을 규명한 사례

Schinzel-Giedion syndrome에 걸린 4명의 비혈연 환자의 엑솜을 평균 40X로 시퀀싱하였다. dbSNP 130, 다른 연구팀의 최근 등록된 SNP data, 자체 연구로 나온 SNP data를 비교하여 SNPs를 필터링하였다. 이 환자들의 95% 이상이 기존에 발견된 SNPs였다.

4명 모두에게서 12개의 유전자가 발견되었고, 오직 2개의 유전자가 서로 다른 유전체 위치에서 잠재적인 원인이 되는 변이를 보였다. 이 두 유전자는 CTBP2SETBP1이었고,CTBP2 유전자는 연구팀의 다른 엑솜 시퀀싱 프로젝트 실험에서 많이 발견되어 추후에 후보 유전자에서 배제되었다. 남은 SETBP1 유전자를 생어 시퀀싱을 통해 검증하였다. 이 유전자는 4명의 환자에게서 heterozygous 상태로 존재하였다. 환자 부모의 DNA를 검사한 결과 모든 돌연변이가 de novo였다. 추가적으로 다른 9명의 환자를 대상으로SETBP1 유전자 돌연변이를 확인해보니 8명에게서 돌연변이가 존재함을 알 수 있었다. 이 8명 환자 중 6명의 부모 DNA를 검사해볼 수 있었고, 검사 결과 이 환자들의 돌연변이도 de novo임을 확인하여 검증할 수 있었다.

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Barter 신드롬으로 진단 받을 뻔한 환자를 엑솜 시퀀싱을 통해 Congenital chloride diarrhea임을 밝힌 연구로 엑솜 시퀀싱을 진단 도구로 실제로 적용한 사례

지속적인 탈수현상과 체중증가부족 현상을 보이는 5세 아이를 Barter 신드롬으로 의심했으나 아이의 엑솜을 시퀀싱하여 선천적인 염화물 설사로 인한 장질환임을 밝혔다. 이 아이가 이 질환을 일으키는 1개의 유전자 SLC26A3에 missense 돌연변이를 갖고 있음을 확인하였다. 이 연구는 엑솜 시퀀싱을 통해 실제 진단에 응용할 수 있음을 보여주는 의미있는 연구이다.

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Ng et al. 2009. Freeman-Sheldon syndrome(FSS)

Freeman-Sheldon syndrome 연구를 위해 비혈연 관계의 4명을 엑솜 시퀀싱하여 MYH3 유전자가 프리맨-쉘던 신드롬의 원인 유전자임을 규명한 사례

알려진 프리맨-쉘던 신드롬의 많은 후보 유전자 중에서 이 질환과 관련이 없는 변이들을 제거해나갔다. 우선, 시퀀싱한 환자의 엑솜의 Non-synonymous 코딩 SNPs, splice site, coding indels 영역을 조사하였다. 그 뒤 dbSNP와 HapMap의 8명의 엑솜에 등록된 common 변이를 필터링하였다. 이러한 과정을 통해 많은 프리맨-쉘던 신드롬의 후보 유전자 수를 의미있게 줄여나갔다. MYH3 유전자는 프리맨-쉘던 신드롬을 가진 4명 모두에게서 문제가 있고, 이 변이는 dbSNP와 HapMap 엑솜 데이터에 포함되지 않았다. 그러므로 열성 유전질환인 프리맨-쉘던 신드롬의 원인 유전자는 MYH3 유전자임을 확인하였다.

이 연구는 멘델리안 질환을 가진 소수의 비혈연 환자의 엑솜을 시퀀싱하는 것이 멘델리안 질환의 원인이 되는 유전자 발굴에 매우 유용함을 보여주었다. 

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멘델리안 질환의 경우 원인 변이가 엑손에서 알려진 변이가 대부분(85%)이다.

그렇기 때문에 전세계적으로 Whole Genome Sequencing(WGS) 방식보다 저렴하고 효율성이 높은 Whole Exome sequencing(WES) 방법을 사용하여 멘델리안 유전 질환을 연구하는 추세이다. 또한 WES 방식을 사용하면 멘델리안 질환 환자가 매우 드물어서 샘플의 확보가 어려운 점을 보완 할 수 있다. 즉 WES 방식으로 멘델리안 질환 환자의 적은 샘플로도 기존 방법으로는 발견할 수 없었던 새로운 변이와 후보 유전자 발굴이 가능한 것이다.

멘델리안 질환을 엑솜 시퀀싱으로 연구하는 전략은 엑솜을 타겟으로 non-synonymous, splice site, coding indel에서의 변이를 확인하는 것이다. 특히 엑솜 영역에서도 아미노산 변화가 단백질 기능에 영향을 미치는 non-synonymous 변이에 초점을 맞춘다. 
가계도와 여러 조건을 고려하여 샘플을 선택하고 엑솜 enrichment 단계를 거쳐 엑솜 시퀀싱을 하게 된다. 엑솜 시퀀싱으로 나온 멘델리안 질환 환자의 엑솜 변이를 필터링하는 전략은 2가지이다. 첫째 멘델리안 질환의 원인 변이가 드물 것이라는 가정 하에 이 환자들의 변이가 기존에 확인되지 않았을 거라고 생각하여 공개된 SNP 데이터 베이스(예, dbSNP, 1000 Genomes Project, HapMap Project 등)에 존재하는 변이들, 즉 common 변이를 제거한다. 둘째, synonymous 변이는 질환을 유발하는 원인이 되지 않을 거라고 가정한다. 즉 deleterious 변이(non-synonymous, nonsense, spilce-site 변이, frameshift indels)만을 고려하여 분석한다. 변이 필터링을 거쳐 나온 후보 유전자와 후보 변이는 생어 시퀀싱 등을 통해 검증 단계를 거쳐 멘델리안 질환의 원인 유전자와 원인 변이를 규명한다.


 

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