Elaine R. Mardis et al., NEJM, 2009



2009년 8월 5일 워싱턴 의과대학교에서 AML 암환자의 암에 대한 모든 정보를 해독함으로써 질병의 복잡성을 풀 수 있는 명확한 청사진을 그리고, 이전까지 예측되지 않았던 유전적 관계를 밝혀냈다. 이 연구팀은 2008년 같은 종류의 암에 걸린 여자 환자의 게놈을 시퀀싱했던 팀이다.


이번 환자는 AML을 진단받고 관해 상태를 유지한 38세 남자이다. 이 남자를 선정하게 된 이유는 이 환자가 AML의 전형적인 임상학적, 분자적 특징을 가졌기 때문이다.


저자들은 이 환자의 종양과 정상 게놈을 시퀀싱함으로써 AML을 일으키는 병인과 관련된 체세포 돌연변이를 발굴하여 AML 환자의 예후를 예측하고 환자에 맞는 적절한 치료를 결정할 수 있게 되기를 기대하고 있다.


AML을 일으키는 병인과 관련된 체세포 돌연변이 발굴 과정은 크게 두 단계이다. 첫 번째는 체세포 돌연변이를 발굴하는 것이고, 두 번째는 찾아낸 체세포 돌연변이가 진짜 암과 관련된 체세포 돌연변이인가를 검증하는 것이다.


체세포 돌연변이 발굴을 위해 환자의 종양과 정상 조직에서 샘플을 채취하여 NGS 기술로 시퀀싱하여 정상과 종양의 유전적 차이를 비교해본다. 암을 유발하는 돌연변이는 후천적으로 돌연변이를 획득한 체세포 돌연변이이므로, 한 사람이 기본적으로 가진 유전체 정보를 레퍼런스 DNA 염기서열로 하여 돌연변이가 축적된 세포들이 모인 암의 유전체 정보를 비교해보면, 어떤 유전적 변이가 암을 유발시키는 지 예측해 볼 수 있다.


체세포 돌연변이를 발굴하는 흐름을 살펴보면,

< Elaine R. Mardis et al., NEJM, 2009>



환자의 종양 세포에서 발견된 3,872,936개 SNP를 Maq 소프트웨어를 통해 3,464,449개의 SNP로 걸러냈다. 종양세포뿐만 아니라 피부에도 존재하는 SNP는 유전되는 변이이므로, 걸러내고 나면 86,769개의 종양의 체세포 돌연변이가 남는다. 그 중 66,513개는 기존에 발견이 보고된 것이므로 제거한다.

최종적으로 잠재적으로 종양 세포의 새로운 체세포 SNV는 20,256개가 된다.

저자들은 유전체 영역으로 더 세분화하여 4개의 Tier로 분류하고 분류된 체세포 돌연변이를 검증하였다.(Tier 1, 2영역만)


최종적으로 750개의 돌연변이를 규명하였지만 거의 대부분이 질병의 발달과 관련되지 않은 임의의, 병을 일으키지 않으면서 존재하고 있는 돌연변이(random, background mutation)임을 더 세밀한 조사를 통해 밝혔다.


추후의 연구에서 환자의 종양에서 매우 중요할 것으로 보이는 64개의 돌연변이를 확인하였다. 그 중 12개는 Tier 1 에 속하는 코딩영역의 돌연변이이다. 이 중에는 신경교종과 관련됐다고는 보고됐지만 AML과는 관련이 있다고 여겨지지 않았던 IDH1 유전자가 포함되어 있다.

나머지 52개 돌연변이는 Tier 2에 속하는 잘 보존된(highly conserved) 영역에 속하는 유전자이다.


다른 187명의 AML 환자에서도 64개 돌연변이는 발견됐다. 또 IDH1 돌연변이는 15명에게서 발견됐는데, AML과 관련된 가장 공통적인 돌연변이로 여겨진다.


이 남자 환자의 논코딩 영역에서 발견된 돌연변이가 다른 AML 환자에게서도 발견됐는데 이것은 주목할 만하다. 왜냐하면 현재 연구는 대부분 게놈의 단백질 코딩 영역에 집중되어 있는 경향이 있는데, 이렇게 규명되어 있지 않고 친숙하지 않은 논코딩 영역에서 AML과 관련될 것으로 보이는 돌연변이가 발견됐다는 것은 논코딩 영역의 돌연변이가 암 병인에 기여할 것이라는 것을 암시하기 때문이다.



환자에게서 발견된 indel



환자의 체세포 indel을 자체 알고리즘을 사용하여 잠정적으로 142개를 발견하였다. 그 중 119개는 PCR 증폭 후 생어 시퀀싱에서 검증에 실패하였고, 21개는 종양과 피부에 존재하였다. 2개만이 체세포 돌연변이로 검증되었는데, 하나는 NPM1 유전자에서 4bp 삽입으로 틀이동 돌연변이를 일으키는, AML 환자에게서 약 30%정도로 발생한다고 알려진 돌연변이이다. 다른 하나는 CEP170 유전자의 아미노산 177자리에 류신을 첨가하게 하는 3bp 삽입이다.


환자에게서 암과 관련된 돌연변이를 발굴하기 위해 환자의 정상 조직과 암 조직을 시퀀싱한 것은 현재 NGS 기술이 더 향상되었고 비용도 절감했기 때문이다. 이 연구에 50만 달러의 비용과 단지 몇 달만이 소요되었는데 이것은 2008년(이 연구 시점의 약 1년도 채 지나지 않은) AML 여자 환자의 게놈을 시퀀싱한 비용의 1/3 수준이다.


워싱턴 대학교 연구자들은 현재 추가적으로 AML 환자의 게놈을 시퀀싱하고 있고 유방암, 폐암, 난소암, 뇌암(glioblastomas)을 시퀀싱을 하여 암을 이해하고 정복하고자 노력하고 있다.


<2008년 AML 환자 게놈과 2009년 AML 환자 게놈 비교>

Sample

Sequencing platform

Max read length(bp)

Tumor coverage

Normal coverage

Coding SNVs

Coding indels

AML(2008*)

Illumina

1 X 36

33X

14X

8

2

AML(2009**)

Illumina

2 X 75

23.3X

21.3X

10

2



워싱턴 대학교 팀의 AML 게놈 연구 논문

* Ley TJ, Mardis ER, Ding L, et al. DNA sequencing of a cytogenetically normal acute myeloid leukaemia genome. Nature 2008;456(7218):66–72.


** Mardis ER, Ding L, Dooling DJ, et al. Recurring mutations found by sequencing an acute myeloid leukemia genome. NEnglJMed 2009;361(11):1058-66.




출처 : http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa0903840#t=abstract


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Kabuki 신드롬을 가진 10명의 비혈연 관계의 환자의 엑솜 시퀀싱을 통해 MLL2 유전자가 원인 유전자임을 규명한 사례

가부키 신드롬은 1981년 일본에서 처음 발견되었고, 현재 32만 명 중 1명이 걸리는 것으로 추정되고 있다. 10명의 가부키 신드롬을 가진 비혈연 관계의 환자의 엑솜을 시퀀싱하였다. 그 후 synonymous 변이를 제거하고, dbSNP129, 1000 Genomes Project, 대조군 엑솜(8명 HapMap, 4명 FSS, 4명 밀러 신드롬), Environmental Genome Project(EGP)의 일환으로 시퀀싱된 10명의 환자들의 엑솜과 비교하여 common 변이를 제거하였다.

10명의 가부키 신드롬을 가진 환자 중 7명이 MLL2 유전자에서 nonsense 치환과 프레임시프트 indel이 있음을 확인하였다. 3명의 케이스를 추가 분석하여 처음에 발견하지 못했던 MLL2 유전자의 기능 손실 변이를 확인하였다. 생어 시퀀싱을 통해 이 3가지 케이스 중 2명에게서 프레임시프트 indel을 확인하였다. 생어 시퀀싱을 통해 추가적으로 43명의 가부키 신드롬인 환자의 MLL2 유전자를 조사하였고, 그 중 MLL2 유전자의 모든 54개의 엑손을 스크린하였다. 이전에는 확인되지 않았던 MLL2 유전자의 non-synonymous, nonsense 또는 프레임시프트 돌연변이를 43명의 케이스 중 26명에게서 확인할 수 있었다.

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